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盘式真空过滤机比较几种PCR克隆方法的优缺点
发表日期:2019/7/16       点击:346

按标准方法转化,并筛选所需克隆(参见实验8) '结果与分析

对TA克隆进行蓝白筛选,如果蓝色菌落较多即T-载体自身连接占优势, 说明载体附加T的效率不高,这在制备T-载体时常见。在白色菌落中也有部分 没有插入目的基因,可能是PCR扩增杂质小片段插入弓丨起的假阳性。

' 思考题

1. 比较几种PCR克隆方法的优缺点。

2. 目的基因经TA克隆后,在后续的蓝白筛选中,如果白色菌落经PCR筛选验 证根本不含目的基因,请分析可能的原因。

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实验14 RACE法获得全长dDNA

实验14 RACE法荻得全长cDNA

cDNA末端快速扩增技术概述如下。RACE (Rapid Amplification of cDNA ends)是一种利用PCR进行cDNA末端快速克隆的技术,是以mRNA为模板逆 转录合成cDNA第一条链后用PCR技术扩增出某个特异位点到3'或5'之间的未 知序列的方法,分别称为3'-RACE或5LRACE。锚定PCR (AnchoredPCR) 反向PCR都可以用于RACE技术,经典RACE就是基于锚定PCR技术原理设计 的,而高特异性的RACE则借助于反向PCR技术。

1。 3'-RACE 扩增

已知序列3'端区域时,先以总RNA为模板,以01ig(dT)-Adaptor为引 Adaptor,接头,图3-9内灰色短线表示),在逆转录酶的作用下合成cDNA 的第一条链。然后将RNA — cDNA.杂合体变性后,加入5'端特异的引物1 (GSP1),使之与Oligo(dT) -Adaptor引物配对,在TagDNA聚合酶作用下扩 增特异引物1的3'端下游区域。为了提髙扩增的特异性,可以在GSP1内侧3' 端侧)设计一个特异引物2 (GSP2),进一步通过巢式PCR高特异性地获得3' 未知序列。GSP2即可以与GSP1隔一段距离的,也可以有部分重叠。Oligo (dT)和GSP2的5'端都含具有黏性末端的接头Adaptor)序列,扩增产物可以 直接克隆测序(图3-9)。

2. 5,-RACE

经典的5'-RACE利用的是锚定PCR原理,在逆转录的cDNA第一链末端添 Poly (dC)尾巴,从而获得引物Oligo (dG)的锚定位点,根据已知区设计的 两对基因特异引物和Oligo (dG)配对,通过巢式PCR获得5'端未知序列。由于 Oligo (dG)为非特异性引物,所以扩增的特异性不高。高特异性的RACE是基 于反向PCR扩增技术设计的,它利用已知序列内部高特异性的嵌套引物进行扩 增的原理,故具有较高的特异性。原理如图3-10所示。①利用5'端磷酸化的基 因特异引物对mRNA逆转录形成5'端磷酸化的cDNA第一链;②用RNase H mRNA;③单链cDNA在T4 RNA Ligase作用下环化(形成首尾相连物); ④用已知区域设计的两对特异引物(外侧引物A1-S1,内侧引物A2-S2)进行巢 PCR,获得特异的5'端序列。

3. 全长cDNA的获得

通过上述方法分别获得3'端和5'端cDNA片段后,进行测序。根据测序结 果,设计3'端和端特异引物,以cDNA为模板,在T叫酶作用下,进行PCR, 可获得全长cDNA。

第二轮 PCR

取灭菌的0.2ml离心管,依次加入下列溶液:

10XPCR 缓冲液(Mg2* plus) 10^1

dNTP (各 2.5mmol/l) 8jul

GSP2-Adaptor (20pmol//utl) l(x\

Oligo (dT) -Adaptor lpl

第一轮PCR产物(稀释10~ 1 〇〇〇倍) lfj

ddH20 78.5^1

TagE

实验14 RACE法获得全长cDNA

0.5M1 (2_5U) 总体积lOOfJ

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混匀,稍离心,放入PCR仪中循环条件为: 94X: lmin (预变性)

941: 30 叫

37 ~ 65X: 30sec [25 ~ 30 cycles

72X: l~5minJ

72X:保温lOmin (补平PCR产物)

取知1电泳检测。

2. 5'端区域的扩增 ⑴逆转录

取灭菌的0.2ml离心管,依次加入下列溶液:

10XRT 缓冲液dNTP) 1.5/ul

RNase Inhibitor (40U/jnl) 0.5/ml

5'-磷酸标记逆转录引物200pmol/Ml) 1^1

AMV Reverse Transcriptase XL (5U//xl) lfxl

Total RNA (l~5pg) x^tl

RNase-free ddH2〇 x(xl

总体积15/J

混匀,稍离心,放入PCR仪中。循环条件为30X: lOmin—50t: 30~60min— 80t: 2miir^4t:保存

(2) Hybrid RNA 的分解 (i )按下列组成配制RNA分解反应液:

5 X RNA Degeneration 缓冲液 15/J cDNA第一条链反应液 15/J

ddH20 45(A

总体积75/J~~

(jj )加入 lpl RNase H , 30t:反应 lhr。

(iii )加入100M1 ddH20,混匀后加入50(V1 100%乙醇,混匀后-20X:沉淀 30min 或-80X:沉淀 15min。

(iV) 12 000rpm离心lOmin回收DNA沉淀,用500/iI70%乙醇洗一次,吹

干。

⑶单链cDNA环化

(i )加入5 X RNA (ssDNA) Ligation 缓冲液和 12/lcI ddH20 溶解单链 cDNA沉淀

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